Marine orme

Nemertine neurotoksiner

Nemertiner er en stamme af marine orme, som bruger en stor, uendelig proboscis til at fange deres bytte.12 De fleste nemertiner er relativt små, uanseelige beboere af kystnære havområder. Det er derfor ikke overraskende, at der er færre end tusind kendte arter. Stammen er blevet opdelt i tre hovedgrupper: hoplonemertiner, der har en stylet (modhager), som er i stand til at punktere huden på et byttedyr, paleonemertiner, som anses for at repræsentere de mest primitive nemertiner, og heteronemertiner. Paleonemertiner og heteronemertiner har tilsyneladende ikke mulighed for at injicere en gift i deres bytte. Selv om hoplonemertinernes giftstoffer bruges til offensive og defensive formål, men det antages, at de to andre grupper bruger deres giftstoffer til at afvise rovdyr.

I 1936 rapporterede den belgiske farmakolog Bacq om sin tilfældige opdagelse af to forskellige typer af giftaktivitet hos nemertinerne.1 Homogenater af en hoplonemertin (Amphiporus lactifloreus) trak isolerede frøskeletmuskler potent sammen og stimulerede kattens cervikale autonome ganglion på en måde, der ligner nikotin. Da denne biologiske aktivitet overlevede stærkt basiske forhold, kunne den ikke skyldes acetylcholin, den neurotransmitter, der normalt stimulerer disse synapser. Ekstrakter af paleonemertiner og heteronemertiner indeholdt en anden type neurotoksisk aktivitet, som i stedet for at påvirke nikotinresponsive celler genererede spiking-aktivitet (aktionspotentiale) i krebsdyrnerver i stedet for at påvirke nikotinresponsive celler. De kaldes henholdsvis “amfiporin” og “la nemertin”, og begge typer homogenater forårsagede kramper, lammelse og død, når de blev injiceret i strandkrabber. Selv om “amphiporine”-aktiviteten let passerede gennem en dialysemembran, passerede “la nemertine”-aktiviteten kun meget langsomt.

Der var gået ca. 30 år, før nemertine-toksinerne blev undersøgt igen. Heldigvis blev mange nye separations- og analysemetoder tilgængelige, hvilket gjorde det lettere at isolere disse naturprodukter selv i relativt små mængder. Disse metoder omfattede tyndtlags- og kolonnekromatografi (og senere HPLC) samt aminosyreanalyse og Edman-sekventeringsmetoder til analyse af peptider. Det første toksin, der blev isoleret, var hoplonemertinalkaloiden anabasein, en nikotinoidforbindelse, der har en biologisk og kemisk profil, der ligner Bacqs “amphiporin”.22 Beslægtede forbindelser, der er beskrevet andetsteds, blev fundet i andre hoplonemertiner.16,19 De farmakologiske egenskaber af anabasein og en række anabaseinderivater er blevet vurderet.25 Et af disse derivater, GTS-21 (også kaldet DMXBA), stimulerer selektivt alfa7 nikotinacetylcholinreceptorer, der er involveret i kognitive hjernefunktioner, og er i øjeblikket under klinisk afprøvning.21,26 Heteronemertiner, selv om de mangler alkaloidtoksiner, besidder peptidneurotoksiner, der ligner aktivitetsprofilen for Bacqs “la nemertine”, samt cytolytiske peptider.16,17

Mange heteronemertiner besidder peptidneurotoksiner, som det fremgår af deres evne til hurtigt at lamme strandkrabber eller ferskvandskrebs.16

De eneste heteronemertintoksiner, der er blevet renset og kemisk karakteriseret til dato, blev imidlertid opnået fra slimhindeudskillelser fra to store (>1-m længde) marine arter. Selv om Cerebratulus lacteus tilhører en meget stor heteronemertine-familie (Lineidae) og er vidt udbredt på de koldere breddegrader i både Atlanterhavet og Stillehavet, er den største art, Parborlasia corrugatus, begrænset til Antarktis og nærliggende kolde farvande på den sydlige halvkugle.

Cerebratulus neurotoksiner har molekylære størrelser på omkring 6000 Da og er tværbundet af tre disulfidbindinger.18 Disse blev oprindeligt betegnet som “B”-toksiner, fordi de elueredes efter en cytolytisk peptid-“A”-fraktion under gelkromatografi. De to hyppigst forekommende og mest aktive toksiner, B-II og B-IV, har meget ens sekvenser.5,8 Begge er meget basiske peptider, der indeholder en enkelt rest af 4-hydroxyprolin nær N-terminus. I modsætning til skorpion- og søanemone-peptid-natriumkanal-neurotoksinerne, hvis sekundære strukturer for det meste består af antiparallelle B-strenge, er B-toksinerne blottet for B-arkstruktur, men rige på alfa-helixer. Sekundærstrukturen af B-IV beregnet ud fra cirkulær dichroisme-målinger lignede den, der var forudsagt ud fra sekvensen.24 B-IV’s opløsningsstruktur blev til sidst bestemt ved hjælp af NMR-metoder.13 To lange strækninger af α-helix, der forekommer ved positionerne 11-23 og 34-49, er forbundet af en løkke bestående af to omvendte gamma-turns og en beta-turn. Det område, der omfatter resterne 11-49, udgør en ret unik helikal hårnåle-struktur.2

Der foreligger betydelige resultater, der implicerer nogle aminosyresidekæder i toksin B-IV’s toksiske virkning. De første undersøgelser anvendte en kemisk modificeringsmetode og fokuserede på de få aromatiske rester (2 tyrosyls, 2 tryptophanyls). Ved at manipulere reaktionsbetingelserne var det muligt at markere disse rester forskelligt, førstnævnte ved nitrering6 og sidstnævnte ved alkylering.4 Ved bioassay af toksinprøverne ved forskellige grader af modifikation blev det udledt, at Tyr 9 og Trp 30 sandsynligvis er involveret i receptorbinding, fordi toksiciteten blev reduceret betydeligt uden ændringer i sekundærstrukturen. Blumenthals laboratorium anvendte efterfølgende molekylærbiologiske metoder til at udtrykke B-IV i Escherichia coli og til at fremskaffe mutanter til struktur-aktivitetsundersøgelser.14,15 De første forsøg viste, at udskiftning af hydroxyprolinet i position 10 med Pro ikke påvirkede krebsens paralytiske aktivitet, og det samme gjorde udskiftning af Ala-rester i enten position 3 eller 8 med serin. Faktisk blev B-IV’s toksicitet forøget ved samtidig substitution af serin på position 3 og 8. Arg17 var involveret i receptorbinding, da toksiciteten ikke kunne påvises, selv om toksin-CD-spektret var uændret, når Glutamin, Ala eller Lys blev substitueret på denne position. Udskiftning af Arg25 med Lys reducerede krebsens toksicitet 400 gange.35 Nogle af de sidekæder, der er impliceret i B-IV’s toksicitet, omfatter guanidinylsidekæderne i Arg 17, 25 og 34 og de aromatiske sidekæder i Tyr 9 og Trp 30. Det var ret overraskende, at disse rester findes langs hele længden af toksinens ene overflade.

Cerebratulus B-IV er ikke giftig, når den injiceres intravenøst til mus, insekter og snegle. Det er imidlertid ekstremt giftigt for krebsdyr, især ferskvandskrebs.18 I første omgang viser krebsdyret rystelser og vridning af halen, men derefter får det kramper med en massiv kontraktur af lemmer og hale. I løbet af få minutter efterfølges den kontrakturelle lammelse af slap lammelse og fører til sidst til døden. Cerebratulus B-toksinets toksicitet synes at være formidlet gennem dets virkning på krebsdyrs nerver, da tetrodotoxin effektivt blokerer virkningen af B-IV på isolerede krebsnerve-muskelpræparater. Ved relativt høje (mikromolære) koncentrationer forårsager toksin B-IV også en vis gentagende spiking i isolerede krebsnerver. Det er sandsynligt, at dette toksin aktiverer en lille population af natriumkanaler, der er tilstrækkelig til at generere spontane nerveaktionspotentialer, der forårsager en massiv frigivelse af exciterende neurotransmitter ved den neuromuskulære synapse.

Lieberman og Blumenthal29 målte bindingen af det jodholdige toksin B-IV til membraner fremstillet fra hummernerver (Homarus vulgaris). Den specifikke binding kunne ikke fortrænges af et alfa-toksin fra skorpioner. SDS-gelelektroforese af radioaktivt mærket toksin krydsbundet til opløste hummernerve-membranproteiner afslørede et 40.000-Da-bånd med en mindre molekylær størrelse end den, der ville være forudsagt for interaktionen med natriumkanalens alfa-subenhed. Dette tyder på, at toksinet kan binde til en mindre (β?) underenhed af natriumkanalen, eller at det interagerer med et andet membranprotein.

Analyser af ekstrakter fra andre heteronemertiner, der tilhører slægten Lineus, viser, at de faktisk er mere giftige end Cerebratulus-ekstrakterne.16 Molekylestørrelserne af disse giftige peptider er 3000-6000 Da.17 Selv om de lammer krebsdyr på en måde, der overfladisk set ikke kan skelnes fra Cerebratulus-toksinerne, forlænger Lineus-toksinerne primært aktionspotentialets varighed i krebsdyrsneuroner, hvorimod Cerebratulus-toksin B-IV forårsager gentagne spiking uden at forsinke repolariseringen af hvert aktionspotentiale væsentligt (Kem, upublicerede resultater).

Skriv et svar

Din e-mailadresse vil ikke blive publiceret.