Meereswürmer

Nemertine Neurotoxine

Nemertinen sind ein Stamm von Meereswürmern, die einen großen, umstülpbaren Rüssel benutzen, um ihre Beute zu fangen.12 Die meisten Nemertinen sind relativ kleine, unauffällige Bewohner der Küstengewässer. Daher ist es nicht verwunderlich, dass weniger als tausend Arten bekannt sind. Der Stamm wurde in drei Hauptgruppen unterteilt: Hoplonemertinen, die einen Rüsselstachel (Widerhaken) besitzen, mit dem sie die Haut eines Beutetiers durchstechen können, Paleonemertinen, die als die primitivsten Nemertinen gelten, und Heteronemertinen. Den Paleonemertinen und Heteronemertinen fehlt offenbar eine Möglichkeit, ein Gift in ihre Beutetiere zu injizieren. Obwohl die Toxine der Hoplonemertinen sowohl offensiv als auch defensiv eingesetzt werden, wird angenommen, dass die anderen beiden Gruppen ihre Toxine zur Abwehr von Raubtieren verwenden.

Im Jahr 1936 berichtete der belgische Pharmakologe Bacq über seine zufällige Entdeckung von zwei verschiedenen Arten toxischer Aktivität bei Nemertinen.1 Homogenate einer Hoplonemertine (Amphiporus lactifloreus) kontrahierten isolierte Froschskelettmuskeln und stimulierten das autonome Ganglion der Katze in einer dem Nikotin ähnlichen Weise. Da diese biologische Aktivität unter stark alkalischen Bedingungen überlebte, konnte sie nicht von Acetylcholin, dem Neurotransmitter, der normalerweise diese Synapsen stimuliert, herrühren. Extrakte aus Paleonemertinen und Heteronemertinen enthielten eine andere Art von neurotoxischer Aktivität, die nicht auf nikotinempfindliche Zellen einwirkte, sondern in Krustentiernerven eine Spiking-Aktivität (Aktionspotential) erzeugte. Beide Arten von Homogenaten verursachten Krämpfe, Lähmungen und den Tod, wenn sie in Landkrabben injiziert wurden. Während die „Amphiporin“-Aktivität problemlos eine Dialysemembran passierte, passierte die „La Nemertin“-Aktivität nur sehr langsam.

Etwa 30 Jahre waren vergangen, bevor die Nemertin-Toxine erneut untersucht wurden. Glücklicherweise standen viele neue Trenn- und Analysemethoden zur Verfügung, die die Isolierung dieser Naturstoffe auch in relativ kleinen Mengen ermöglichten. Zu diesen Methoden gehörten die Dünnschicht- und Säulenchromatographie (und später die HPLC) sowie die Aminosäureanalyse und die Edman-Sequenzierungsmethoden zur Analyse von Peptiden. Das erste Toxin, das isoliert wurde, war das Hoplonemertin-Alkaloid Anabasein, eine nikotinoide Verbindung, die ein ähnliches biologisches und chemisches Profil wie das „Amphiporin“ von Bacq aufweist.22 Verwandte Verbindungen, die an anderer Stelle beschrieben wurden, wurden in anderen Hoplonemertinen gefunden.16,19 Die pharmakologischen Eigenschaften von Anabasein und einer Reihe von Anabasein-Derivaten wurden untersucht.25 Eines dieser Derivate, GTS-21 (auch DMXBA genannt), stimuliert selektiv Alpha7-Nicotin-Acetylcholin-Rezeptoren, die an der kognitiven Gehirnfunktion beteiligt sind, und wird derzeit klinisch getestet.21,26 Heteronemertine besitzen zwar keine Alkaloidtoxine, aber Peptidneurotoxine, die dem Aktivitätsprofil von Bacqs „la nemertine“ ähneln, sowie zytolytische Peptide.16,17

Viele Heteronemertine besitzen Peptidneurotoxine, die durch ihre Fähigkeit, Landkrabben oder Süßwasserkrebse schnell zu lähmen, nachgewiesen wurden.16 Die einzigen Heteronemertin-Toxine, die bisher gereinigt und chemisch charakterisiert wurden, stammen jedoch aus den Schleimsekreten von zwei großen (>1 m Länge) marinen Arten. Obwohl Cerebratulus lacteus zu einer sehr großen Heteronemertin-Familie (Lineidae) gehört und in den kälteren Breitengraden sowohl des Atlantiks als auch des Pazifiks weit verbreitet ist, ist die größte Art, Parborlasia corrugatus, auf die Antarktis und die nahe gelegenen kalten Gewässer der südlichen Hemisphäre beschränkt.

Cerebratulus-Neurotoxine haben eine Molekülgröße von etwa 6000 Da und sind durch drei Disulfidbindungen vernetzt.18 Sie wurden ursprünglich als „B“-Toxine bezeichnet, weil sie bei der Gelchromatographie nach einer zytolytischen „A“-Fraktion eluierten. Die sehr ähnlichen Sequenzen der beiden häufigsten und aktivsten Toxine, B-II und B-IV, sind bekannt.5,8 Bei beiden handelt es sich um sehr basische Peptide, die einen einzigen 4-Hydroxyprolin-Rest in der Nähe des N-Terminus enthalten. Im Gegensatz zu den Skorpion- und Seeanemonen-Peptid-Natriumkanal-Neurotoxinen, deren Sekundärstrukturen meist aus antiparallelen B-Strängen bestehen, weisen die B-Toxine keine B-Faltblattstruktur auf, sondern sind reich an Alpha-Helixen. Die anhand von Zirkulardichroismusmessungen berechnete Sekundärstruktur von B-IV entsprach der aus der Sequenz vorhergesagten Struktur.24 Die Lösungsstruktur von B-IV wurde schließlich mit NMR-Methoden bestimmt.13 Zwei lange Abschnitte der α-Helix, die an den Positionen 11-23 und 34-49 auftreten, sind durch eine Schleife verbunden, die aus zwei umgekehrten Gamma-Turns und einem Beta-Turn besteht. Der Bereich, der die Reste 11-49 umfasst, stellt eine ziemlich einzigartige helikale Haarnadelstruktur dar.2

Es liegen beachtliche Ergebnisse vor, die einige Aminosäureseitenketten in die toxische Wirkung von Toxin B-IV einbeziehen. Die ersten Studien verwendeten einen chemischen Modifikationsansatz und konzentrierten sich auf die wenigen aromatischen Reste (2 Tyrosyle, 2 Tryptophanyle). Durch Manipulation der Reaktionsbedingungen war es möglich, diese Reste unterschiedlich zu markieren, erstere durch Nitrierung6 und letztere durch Alkylierung.4 Durch Bioassay der Toxinproben mit unterschiedlichem Modifizierungsgrad wurde abgeleitet, dass Tyr 9 und Trp 30 wahrscheinlich an der Rezeptorbindung beteiligt sind, da die Toxizität ohne Veränderung der Sekundärstruktur deutlich reduziert wurde. Blumenthals Laboratorium setzte daraufhin molekularbiologische Methoden ein, um B-IV in Escherichia coli zu exprimieren und Mutanten für Struktur-Aktivitäts-Studien zu erhalten.14,15 Erste Experimente zeigten, dass der Ersatz des Hydroxyprolins an Position 10 durch Pro keine Auswirkungen auf die paralytische Aktivität des Flusskrebses hatte, ebenso wenig wie der Ersatz von Ala-Resten an Position 3 oder 8 durch Serin. Vielmehr wurde die Toxizität von B-IV durch den gleichzeitigen Ersatz von Serin an den Positionen 3 und 8 verstärkt. Arg17 wurde in die Rezeptorbindung einbezogen, da die Toxizität nicht nachweisbar war, obwohl das CD-Spektrum des Toxins unverändert blieb, wenn Glutamin, Ala oder Lys an dieser Position ersetzt wurde. Der Ersatz von Arg25 durch Lys verringerte die Toxizität für Krebse um das 400-fache.35 Zu den Seitenketten, die an der Toxizität von B-IV beteiligt sind, gehören die Guanidinyl-Seitenketten der Args 17, 25 und 34 sowie die aromatischen Seitenketten von Tyr 9 und Trp 30. Es war ziemlich überraschend, dass diese Reste auf der gesamten Länge einer Oberfläche des Toxins zu finden sind.

Cerebratulus B-IV ist nicht toxisch, wenn es Mäusen, Insekten und Schnecken intravenös injiziert wird. Es ist jedoch extrem giftig für Krebstiere, insbesondere für Süßwasserkrebse.18 Zunächst zeigt ein Krebstier Zittern und Schwanzschlagen, dann aber Krämpfe mit massiven Kontrakturen der Gliedmaßen und des Schwanzes. Innerhalb weniger Minuten folgt auf die kontraktile Lähmung eine schlaffe Lähmung, die schließlich zum Tod führt. Die Toxizität der Cerebratulus-B-Toxine scheint durch ihre Wirkung auf Krebsnerven vermittelt zu werden, da Tetrodotoxin die Wirkung von B-IV auf isolierte Krebsnerven-Muskel-Präparate wirksam blockiert. In relativ hohen (mikromolaren) Konzentrationen verursacht das Toxin B-IV auch einige repetitive Spikes in isolierten Krebsnerven. Es ist wahrscheinlich, dass dieses Toxin eine kleine Population von Natriumkanälen aktiviert, die ausreicht, um spontane Nervenaktionspotentiale zu erzeugen, die eine massive Freisetzung von erregenden Neurotransmittern an der neuromuskulären Synapse verursachen.

Lieberman und Blumenthal29 maßen die Bindung von jodiertem Toxin B-IV an Membranen, die aus Hummernerven (Homarus vulgaris) präpariert wurden. Die spezifische Bindung konnte nicht durch ein Skorpion-Alpha-Toxin verdrängt werden. Die SDS-Gelelektrophorese von radioaktiv markiertem Toxin, das mit solubilisierten Hummer-Nervenmembranproteinen vernetzt war, ergab eine 40.000-Da-Bande, die eine geringere Molekülgröße aufweist, als für die Interaktion mit der Natriumkanal-Alpha-Untereinheit vorhergesagt würde. Dies deutet darauf hin, dass das Toxin an eine kleinere (β?) Untereinheit des Natriumkanals bindet oder mit einem anderen Membranprotein interagiert.

Untersuchungen von Extrakten aus anderen Heteronemertinen der Gattung Lineus deuten darauf hin, dass sie tatsächlich giftiger sind als die Cerebratulus-Extrakte.16 Die Molekulargröße dieser toxischen Peptide beträgt 3000-6000 Da.17 Obwohl sie Krebstiere auf eine Art und Weise lähmen, die oberflächlich betrachtet nicht von den Cerebratulus-Toxinen zu unterscheiden ist, verlängern die Lineus-Toxine in erster Linie die Dauer des Aktionspotenzials in den Neuronen der Krebstiere, während das Cerebratulus-Toxin B-IV repetitive Spikes verursacht, ohne die Repolarisierung der einzelnen Aktionspotenziale signifikant zu verzögern (Kem, unveröffentlichte Ergebnisse).

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