Gusanos marinos

Neurotoxinas nemertinas

Los nemertinos son un filo de gusanos marinos que utilizan una gran probóscide eversible para capturar a sus presas.12 La mayoría de los nemertinos son habitantes relativamente pequeños y poco visibles de las aguas costeras marinas. Por ello, no es de extrañar que se conozcan menos de mil especies. El filo se ha subdividido en tres grupos principales: los hoplonemertinos que poseen un estilete de probóscide (púa) capaz de perforar la piel de un animal de presa, los paleonemertinos, que se considera que representan los nemertinos más primitivos, y los heteronemertinos. Los paleonemertinos y los heteronemertinos carecen aparentemente de un medio para inyectar un veneno en su presa. Aunque las toxinas de los hoplonemertinos se utilizan con fines ofensivos y defensivos, se cree que los otros dos grupos utilizan sus toxinas para repeler a los depredadores.

En 1936, el farmacólogo belga Bacq informó de su descubrimiento fortuito de dos tipos diferentes de actividad tóxica en los nemertinos.1 Los homogeneizados de una hoplonemertina (Amphiporus lactifloreus) contrajeron potentemente el músculo esquelético aislado de la rana y estimularon el ganglio autonómico cervical del gato de forma similar a la nicotina. Como esta actividad biológica sobrevivió a condiciones altamente alcalinas, no pudo ser el resultado de la acetilcolina, el neurotransmisor que normalmente estimula estas sinapsis. Los extractos de paleonemertinas y heteronemertinas contenían un tipo diferente de actividad neurotóxica que, en lugar de afectar a las células que responden a la nicotina, generaba una actividad en espiga (potencial de acción) en los nervios de los crustáceos. Se denominan, respectivamente, «anfiporina» y «la nemertina», y ambos tipos de homogeneizados provocaban convulsiones, parálisis y la muerte cuando se inyectaban en cangrejos de costa. Aunque la actividad de la «anfiporina» pasaba fácilmente a través de una membrana de diálisis, la actividad de la «nemertina» sólo lo hacía muy lentamente.

Han pasado unos 30 años antes de que se volvieran a investigar las toxinas de la nemertina. Afortunadamente, se dispuso de muchos métodos nuevos de separación y análisis que facilitaron el aislamiento de estos productos naturales incluso en cantidades relativamente pequeñas. Estos métodos incluían la cromatografía en capa fina y en columna (y posteriormente la HPLC), así como el análisis de aminoácidos y los métodos de secuenciación Edman para el análisis de péptidos. La primera toxina aislada fue el alcaloide de la hoplonemertina, la anabaseína, un compuesto nicotinoide que posee un perfil biológico y químico similar a la «anfiporina» de Bacq.22 En otras hoplonemertinas se encontraron compuestos relacionados, descritos en otros lugares.16,19 Se han evaluado las propiedades farmacológicas de la anabaseína y de una variedad de derivados de la anabaseína.25 Uno de estos derivados, el GTS-21 (también llamado DMXBA), estimula selectivamente los receptores de acetilcolina nicotínicos alfa7 que están implicados en la función cerebral cognitiva y actualmente se está sometiendo a pruebas clínicas.21,26 Las heteronemertinas, aunque carecen de toxinas alcaloides, poseen neurotoxinas peptídicas que se asemejan al perfil de actividad de «la nemertina» de Bacq, así como péptidos citolíticos.16,17

Muchas heteronemertinas poseen neurotoxinas peptídicas, como se ha comprobado por su capacidad de paralizar rápidamente a los cangrejos de costa o de agua dulce.16 Sin embargo, las únicas toxinas heteronemertinas que se han purificado y caracterizado químicamente hasta la fecha se obtuvieron de las secreciones mucosas de dos especies marinas de gran tamaño (>1 m de longitud). Aunque Cerebratulus lacteus pertenece a una familia de heteronemertinos muy grande (Lineidae) y está ampliamente distribuida en las latitudes más frías de los océanos Atlántico y Pacífico, la especie más grande, Parborlasia corrugatus, está confinada a la Antártida y a las aguas frías cercanas del hemisferio sur.

Las neurotoxinas de Cerebratulus tienen tamaños moleculares de unos 6000 Da y están reticuladas por tres enlaces disulfuro.18 Originalmente se designaban como toxinas «B» porque eludían después de una fracción «A» de péptidos citolíticos durante la cromatografía en gel. Se conocen las secuencias muy similares de las dos toxinas más abundantes y activas, B-II y B-IV.5,8 Ambas son péptidos muy básicos que contienen un único residuo de 4-hidroxiprolina cerca del N-terminal. A diferencia de las neurotoxinas del canal de sodio de los péptidos del escorpión y de la anémona de mar, cuyas estructuras secundarias consisten principalmente en filamentos B antiparalelos, las toxinas B carecen de estructura de hoja B pero son ricas en hélices alfa. La estructura secundaria de la B-IV calculada a partir de mediciones de dicroísmo circular era similar a la predicha a partir de la secuencia.24 La estructura en solución de la B-IV se determinó finalmente mediante métodos de RMN.13 Dos largos tramos de α-hélice que se encuentran en las posiciones 11-23 y 34-49 están conectados por un bucle formado por dos giros gamma inversos y un giro beta. La región que abarca los residuos 11-49 constituye una estructura de horquilla helicoidal bastante singular.2

Se dispone de resultados considerables que implican a algunas cadenas laterales de aminoácidos en la acción tóxica de la toxina B-IV. Los estudios iniciales utilizaron un enfoque de modificación química y se centraron en los pocos residuos aromáticos (2 tirosilos, 2 triptófanos). Mediante la manipulación de las condiciones de las reacciones, fue posible etiquetar diferencialmente estos residuos, los primeros por nitración6 y los segundos por alquilación.4 Mediante el bioensayo de las muestras de toxina en diferentes grados de modificación, se dedujo que la Tyr 9 y la Trp 30 están probablemente implicadas en la unión al receptor, porque la toxicidad se redujo significativamente sin cambios en la estructura secundaria. Posteriormente, el laboratorio de Blumenthal utilizó métodos de biología molecular para expresar la B-IV en Escherichia coli y obtener mutantes para estudios de estructura-actividad.14,15 Los experimentos iniciales mostraron que la sustitución de la hidroxiprolina en la posición 10 por Pro no afectaba a la actividad paralizante del cangrejo de río, como tampoco lo hacía la sustitución de los residuos Ala en la posición 3 u 8 por serina. De hecho, la toxicidad del B-IV aumentó con la sustitución simultánea de la serina en las posiciones 3 y 8. Arg17 estaba implicado en la unión al receptor, ya que la toxicidad era indetectable, aunque el espectro de CD de la toxina no cambiaba cuando se sustituía Glutamina, Ala o Lys en esta posición. La sustitución de Arg25 por Lys redujo la toxicidad del cangrejo de río 400 veces.35 Algunas de las cadenas laterales implicadas en la toxicidad del B-IV incluyen las cadenas laterales de guanidinilo de Args 17, 25 y 34 y las cadenas laterales aromáticas de Tyr 9 y Trp 30. Resulta bastante sorprendente que estos residuos se encuentren a lo largo de toda la superficie de la toxina.

Cerebratulus B-IV no es tóxico cuando se inyecta por vía intravenosa en ratones, insectos y caracoles. Sin embargo, es extremadamente tóxico para los crustáceos, especialmente para el cangrejo de río.18 Inicialmente, el crustáceo muestra temblores y volteo de la cola, pero luego convulsiona con una contracción masiva de las extremidades y la cola. En pocos minutos, la parálisis contráctil es seguida por una parálisis flácida y finalmente conduce a la muerte. La toxicidad de las toxinas de Cerebratulus B parece estar mediada por su acción sobre los nervios de los crustáceos, ya que la tetrodotoxina bloquea eficazmente la acción de B-IV sobre preparaciones aisladas de músculos nerviosos de cangrejos de río. A concentraciones relativamente altas (micromolares), la toxina B-IV también provoca algunos picos repetitivos en nervios aislados de cangrejo. Es probable que esta toxina active una pequeña población de canales de sodio suficiente para generar potenciales de acción nerviosa espontáneos que causen una liberación masiva de neurotransmisor excitatorio en la sinapsis neuromuscular.

Lieberman y Blumenthal29 midieron la unión de la toxina B-IV yodada a membranas preparadas a partir de nervios de langosta (Homarus vulgaris). La unión específica no pudo ser desplazada por una toxina alfa de escorpión. La electroforesis en gel SDS de la toxina marcada radiactivamente y reticulada a las proteínas de la membrana del nervio de la langosta solubilizada reveló una banda de 40.000-Da, de un tamaño molecular más pequeño que el que se predeciría para la interacción con la subunidad alfa del canal de sodio. Esto sugiere que la toxina puede unirse a una subunidad más pequeña (β?) del canal de sodio o que interactúa con alguna otra proteína de membrana.

Los ensayos de extractos de otros heteronemertinos pertenecientes al género Lineus indican que son realmente más tóxicos que los extractos de Cerebratulus.16 Los tamaños moleculares de estos péptidos tóxicos son de 3000-6000 Da.17 Aunque paralizan a los crustáceos de una manera que es superficialmente indistinguible de las toxinas de Cerebratulus, las toxinas de Lineus prolongan principalmente la duración del potencial de acción en las neuronas de los crustáceos, mientras que la toxina B-IV de Cerebratulus provoca picos repetitivos sin retrasar significativamente la repolarización de cada potencial de acción (Kem, resultados no publicados).

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