Marine Worm

Nemertine Neurotoxins

Nemertines são um filo de vermes marinhos que usam uma grande e sempre possível probóscide para capturar suas presas.12 A maioria dos nemertines são relativamente pequenos, habitantes inconspícuos das águas costeiras marinhas. Assim, não é surpreendente que menos de mil espécies sejam conhecidas. O filo foi subdividido em três grupos principais: os hoplonemertinos que possuem um estilete de probóscide (barbela) capaz de perfurar a pele de um animal de presa, os paleonemertinos que são considerados como representando os nemertinos mais primitivos, e os heteronemertinos. Paleonemertinos e heteronemertinos aparentemente carecem de um meio de injecção de um veneno nas suas presas. Embora as toxinas hoplonemertinas sejam usadas para fins ofensivos e defensivos, acredita-se que os outros dois grupos usam suas toxinas para repelir predadores.

Em 1936, o farmacologista belga Bacq relatou sua descoberta serendipital de dois tipos diferentes de atividade tóxica em nemertinos.1 Homogenatos de uma hoplonemertina (Amphiporus lactifloreus) contraíram potentemente o músculo esquelético isolado da rã e estimularam o gânglio autônomo cervical do gato de forma semelhante à nicotina. Como essa atividade biológica sobreviveu a condições altamente alcalinas, ela não poderia resultar da acetilcolina, o neurotransmissor que normalmente estimula essas sinapses. Extratos de paleonemertinas e heteronemertinas continham um tipo diferente de atividade neurotóxica que, ao invés de afetar as células que respondem à nicotina, gerava spiking (potencial de ação) de atividade em nervos crustáceos. Estes são, respectivamente, chamados “amphiporine” e “la nemertine”, e ambos os tipos de homogeneizados causavam convulsões, paralisia e morte quando injetados em caranguejos costeiros. Embora a atividade “amphiporina” tenha passado rapidamente através de uma membrana de diálise, a atividade “la nemertine” só passou muito lentamente.

Sobre 30 anos antes das toxinas nemertinas terem sido reinvestidas. Felizmente, muitos novos métodos de separação e análise se tornaram disponíveis, facilitando o isolamento destes produtos naturais mesmo em quantidades relativamente pequenas. Estes métodos incluíam cromatografia em camada fina e em coluna (e posteriormente HPLC), bem como análise de aminoácidos e métodos de sequenciamento de Edman para a análise de peptídeos. A primeira toxina isolada foi a anabaseína alcalóide hoplonemertina, um composto nicotinóide que possui um perfil biológico e químico semelhante à “amphiporina” de Bacq22. Compostos relacionados, descritos em outros lugares, foram encontrados em outros hoplonemertinos.16,19 As propriedades farmacológicas da anabaseína e de uma variedade de derivados da anabaseína foram avaliadas.25 Um destes derivados, o GTS-21 (também chamado DMXBA), estimula seletivamente os receptores alfa-7 nicotínicos de acetilcolina que estão envolvidos no funcionamento cognitivo do cérebro e está atualmente sendo submetido a testes clínicos.21,26 As heteronemertinas, embora não possuam toxinas alcalóides, possuem neurotoxinas peptídeas que se assemelham ao perfil de atividade da Bacq “la nemertine”, bem como peptídeos citolíticos.16,17

Muitas heteronemertinas possuem neurotoxinas peptídeas, conforme testado pela sua capacidade de paralisar rapidamente caranguejos da costa ou lagostins de água doce.16 Entretanto, as únicas toxinas heteronemertinas que foram purificadas e quimicamente caracterizadas até o momento foram obtidas das secreções mucosas de duas grandes (>1-m de comprimento) espécies marinhas. Embora Cerebratulus lacteus pertença a uma família heteronemertina muito grande (Lineidae) e esteja amplamente distribuída nas latitudes mais frias dos oceanos Atlântico e Pacífico, a maior espécie, Parborlasia corrugatus, está confinada à Antártica e às águas frias do hemisfério sul.

As neurotoxinas Cerebratulus têm tamanhos moleculares de cerca de 6000 Da e são reticuladas por três ligações de dissulfeto.18 Estas foram originalmente designadas como toxinas “B” porque eluem após uma fração “A” do peptídeo citolítico durante a cromatografia em gel. As sequências muito semelhantes das duas toxinas mais abundantes e ativas, B-II e B-IV, são conhecidas.5,8 Ambas são peptídeos muito básicos contendo um único resíduo de 4-hidroxiprolina perto do N-termino. Ao contrário do escorpião e das neurotoxinas do canal de sódio do peptídeo anemônio marinho, cujas estruturas secundárias consistem principalmente de cadeias B antiparalelas, as toxinas B são desprovidas de estrutura de folha B, mas ricas em alfa-helix. A estrutura secundária da B-IV calculada a partir de medidas circulares de dicroísmo foi semelhante à prevista na sequência.24 A estrutura da solução da B-IV foi eventualmente determinada por métodos de RMN.13 Dois longos trechos da hélice α que ocorrem nas posições 11-23 e 34-49 estão ligados por um laço composto por duas voltas gama inversa e uma volta beta. A região que engloba os resíduos 11-49 constitui uma estrutura de grampos capilares helicoidais bastante única.2

Resultados consideráveis estão disponíveis implicando algumas cadeias laterais de aminoácidos na ação tóxica da toxina B-IV. Os estudos iniciais utilizaram uma abordagem de modificação química e focalizaram os poucos resíduos aromáticos (2 tirosis, 2 triptofanilos). Pela manipulação das condições das reações, foi possível rotular diferentemente esses resíduos, o primeiro por nitração6 e o segundo por alquilação.4 Pelo bioensaio das amostras de toxina em diferentes graus de modificação, deduziu-se que o Tyr 9 e o Trp 30 estão provavelmente envolvidos na ligação dos receptores, pois a toxicidade foi significativamente reduzida sem alterações na estrutura secundária. O laboratório de Blumenthal subsequentemente utilizou métodos biológicos moleculares para expressar B-IV em Escherichia coli e para obter mutantes para estudos de estrutura-actividade.14,15 Experiências iniciais mostraram que a substituição da hidroxiprolina na posição 10 por Pro não afectou a actividade paralítica de lagostim, nem a substituição dos resíduos de Ala em qualquer das posições 3 ou 8 por serina. Na verdade, a toxicidade do B-IV foi aumentada pela substituição simultânea da serina nas posições 3 e 8. Arg17 foi implicado na ligação do receptor, uma vez que a toxicidade era indetectável, embora o espectro da toxina CD não tenha sido alterado quando Glutamina, Ala ou Lys foi substituído nesta posição. A substituição de Arg25 por Lys reduziu a toxicidade do lagostim em 400 vezes.35 Algumas das cadeias laterais implicadas na toxicidade do B-IV incluem as cadeias laterais de guanidinil de Args 17, 25 e 34 e as cadeias laterais aromáticas de Tyr 9 e Trp 30. Foi bastante surpreendente que estes resíduos sejam encontrados ao longo de toda a extensão de uma superfície da toxina.

Cerebratulus B-IV não é tóxico quando injetado intravenoso em ratos, insetos e caramujos. No entanto, é extremamente tóxico para crustáceos, especialmente lagostins de água doce.18 Inicialmente, um crustáceo exibe tremores e virada da cauda, mas depois convulsa com uma contração maciça dos membros e cauda. Em poucos minutos, a paralisia contratual é seguida por paralisia flácida e eventualmente leva à morte. A toxicidade das toxinas Cerebratulus B parece ser mediada através da sua acção sobre os nervos crustáceos, uma vez que a tetrodotoxina bloqueia eficazmente a acção da B-IV em preparações isoladas de músculo nervoso nervoso de lagostim. Em concentrações relativamente altas (micromolares), a toxina B-IV também causa alguns picos repetitivos em nervos de caranguejo isolados. É provável que esta toxina ativa uma pequena população de canais de sódio suficiente para gerar potenciais espontâneos de ação nervosa que causam uma liberação maciça de neurotransmissor excitatório na sinapse neuromuscular.

Lieberman e Blumenthal29 mediram a ligação da toxina iodada B-IV em membranas preparadas a partir de nervos de lagosta (Homarus vulgaris). A ligação específica não poderia ser deslocada por um escorpião alfa-toxina. A eletroforese em gel SDS de toxina radioativamente rotulada como reticulada a proteínas da membrana nervosa da lagosta solubilizada revelou uma faixa de 40.000-Da, de menor tamanho molecular do que seria previsto para a interação com o subunidade alfa do canal de sódio. Isto sugere que a toxina pode se ligar a uma subunidade menor (β?) do canal de sódio ou que interage com alguma outra proteína de membrana.

Os ensaios de extratos de outras heteronemertinas pertencentes ao gênero Lineus indicam que eles são na verdade mais tóxicos que os extratos de Cerebratulus.16 Os tamanhos moleculares destes peptídeos tóxicos são 3000-6000 Da.17 Embora paralisem os crustáceos de uma forma que é superficialmente indistinguível das toxinas Cerebratulus, as toxinas Lineus prolongam principalmente a duração do potencial de ação nos neurônios crustáceos, enquanto a toxina Cerebratulus B-IV causa spiking repetitivo sem retardar significativamente a repolarização de cada potencial de ação (Kem, resultados não publicados).

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